一、称取
用度1/100的电子天平称取培养基所需药品。先根据配方计算出配制一定量培养基所需各种成分药品的量，然后用天平准确称取。称量时用称量纸折叠成簸箕状盛放药品。称量纸折叠方法如图所示。
二、溶化
培养基放入烧杯或搪瓷缸中，慢慢加入少量所需水，边加入边用玻棒搅拌。如果培养基中不含有琼脂，培养基不需要加热;如果含有琼脂，则需要用本生灯或电磁炉加热煮沸，完全溶解后，再补齐所需水，并搅拌均匀(如图3所示)。如果配制的培养基量很大，可用不锈钢锅加热溶化，可先用温水加热并随时搅动，防止焦化，如有焦化现象，配制的培养基就不能使用，要重新配制。
配制培养基时不可用铜或铁的容器溶化，因铜或铁制容器可能会使培养基中的铜和铁的含量超标，影响实验(培养基中铜含量大于0.3mg/L，细菌不宜生长，铁含量超过0.14mg/L，妨碍细菌产毒素)。对容易发生反应，产生沉淀的药品，要分开溶解，后加入培养基，如磷酸氢二钾和硫酸镁。
三、调pH
虽然培养基中含有缓冲物质成分，能使培养基的pH尽可能的保持在要求的范围内，但是配出的培养基若不符合要求，就要进行必要的调整。如果有已校准pH计，可用pH计，如果没有，可用精密的pH试纸，再根据需要用1 mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸(微调可用0.1氢氧化钠或0.1mol/L盐酸)调制所需的pH。培基的pH一般为7.4～7.6，也有酸性或碱性的。用氢氧化钠调整的需要高压灭菌的培养基，在调整pH时要调至高出所需0.1个～0.2个单位，因用氢氧化钠调整时，高压灭菌后，培养基的pH要降低0.1~0.2。如培养基中含有碳酸钙成分，可不pH。
四、过滤
配成的培养基，若无特殊要求，可省略此步。若有沉淀或浑浊.需要澄清的.液体培养基可用油纸过滤。而固体培养基可用中间夹一薄层脱脂棉的双层纱布过滤。如果过滤法还不能达到澄清的要求，则可用蛋清澄清法，即培养基加热冷却到50~60℃，装入三角瓶内(不超过容量的二分之一)，按1000mL加人1个～2个鸡蛋的蛋清，用力摇晃3-5min，高压蒸汽灭菌121℃、20min，取出趁热过滤即可。
五、分装
配制好的培养基根据不同的用途分装在三角瓶、试管等容器中，分装试管，如果试管量很大，可用自动分液器，如果试管量少，可用漏斗分装。分装量不超过容器容积的三分之二。三角瓶以不超过容积的二分之一为宜;琼脂斜面以不超过试管长度的五分之一为宜，灭菌后，摆成的斜面为培养基量的三分之一，底层为三分之二的量为宜;半固体琼脂分装量为试管长度的三分之一;用来接种或保菌的高层琼脂，分装量为试管长度的四分之一或三分之一，用来接种厌氧菌的要达到三分之二;琼脂平板，内径为90mm的以13mL~15 mL为宜，内径70mm的平板为8mL~10 mL，制成的琼脂平板若表面水分较多，可将平板倒扣，放置在37℃培养箱内30min，干燥后再用。每批培养基应另外分装一小玻璃瓶(约20mL)与该批培养基同时灭菌，为测定该批培养基终pH。
六、灭菌
分装好的培养基应立即进行灭菌。灭菌的方法种类如下：
1. 高压蒸汽灭菌法
大多耐热培养基都可用此法，小量分装时，用121℃，15min;灭菌量大时，用121℃，30min灭菌;含糖类的培养基只能113~115℃，15min灭菌，避免糖类遭破坏。
2.煮沸灭菌法
对含有不耐高温物质的培养基，可使用此方法。
3.过滤除菌
以过滤的方法除菌，用无菌操作技术，定量加入培养基。血液、抗生素可用无菌操作技术抽取，加入冷却到50℃左右的培养基中。培养基含有不耐热的物质时，可用此法。
对LST培养基进行灭菌时，有时发酵管内会有气泡。为防止发酵管内产生气泡，可以采取以下几项措施：
1. 小倒管浸满培养基(不留气泡)后再加入到盛LST的试管中。
2.灭菌锅关闭放气阀前，将锅内气体排干净。
3.试管塞不要塞得太紧(使用硅胶塞的时候)，勿使用橡皮塞。
4不要过早打开灭菌锅，要等灭菌锅内气压和温度都降到与室温一致或相差不大时再打开灭菌锅。
如果以上情况都做到还有气泡，可用水做培养基组的对照试验，若培养基组有气泡，而对照组没有气泡可确定是培养基自身的原因。
七、倒平板
灭菌融化的培养基冷却到50℃后，倒入无菌干燥的培养皿中。培养基的温度不能过高，否则容易在培养皿的内盖上形成太多的冷凝水;温度太低，培养基又容易凝固成块，无法制成平板。倒平板时，应在靠近酒精灯火焰进行，以免外界的杂菌落入平板内，左手拿培养皿，右手拿三角瓶的底部，用左手的小指和手掌部位把三角瓶的棉塞拔下，灼烧瓶口，用大拇指和食指把培养皿盖打开一条缝，至瓶口刚好伸入，倒入培养基，以铺满底为限，不超过培养皿高度的三分之一，迅速盖好盖，放在桌面上，轻轻地转动培养皿，使培养基分布均匀，冷凝后即可。
八、摆斜面
装在试管中的琼脂培养基，在灭菌完成后，趁热立即摆放在木棒(或玻璃棒)上，并成适当的斜度，冷却后，琼脂凝固即成斜面。斜面长度不用超过试管二分之一。
九、质量检查
培养基灭菌后仔细检查一遍，发现有破裂、水分浸入、色泽异常、棉塞被培养基沾染，都要丢弃，不能再用。并测定其终pH。还需进行无菌检查和效果检查。无菌检查是将灭菌后的培养基取1管(瓶)~2管(瓶)，37℃恒温培养1d～2d，确定无杂菌生长;效果检查是用标准菌株接种在相关的培养基上检查检查菌的生长、形态及生化情况，与已知情况相符。两种情况都合格，配制的培养基方可使用。
