（一)原理

　　Pctrifilm TM酵母菌和霉菌(Pctrifilm TM Yeast and Mold, PYM)测试片是一种预先制备好培养基的霉菌和酵母菌计数的卡片。培养基中有作为载体的冷水可溶性凝胶和对酵母菌和霉菌敏感的5-溴-4-氯-3吲哚基-磷酸盐指示剂，以及抑制细菌生长的四环素、氯霉素。圆形生长区域划分为30个1 cm x1 cm的方格用来计数。

　　(二)设备和材料

　　恒温培养箱(25 ℃~28 ℃),冰箱(0℃~4℃),均质器(旋刀式或拍击式),移液器， Pctrifilm TM测试片压板，振荡器，天平(感量0.1 g),培养基和试剂， Pctrifilm TM酵母菌和霉菌测试片，稀释液， Butterfield's磷酸盐缓冲液， 0.1%蛋白胨水。

　　（三）操作

　　1.固体

　　以无菌操作将25 g样品加入到225 mL的稀释液(磷酸盐缓冲液或0.1%蛋白胨水)中，8000 r/min均质2 min (或放入无菌均质袋中，用均质器拍打2min),制成1 :10样品匀液。

　　2.液体

　　取25 mL样品原液，放入装有225 mL,稀释液的无菌玻璃瓶中，以30 cm幅度， 7s内振摇25次，制成1 : 10样品匀液。

　　将上述匀液做10倍系列梯度稀释，根据样品的污染程度，选择适宜的2个-3个连续稀释度，每个稀释度接种2张测试片。

　　将PYM检验测试片放在平坦的实验台上，揭开上层膜，用移液器将1 ml样液加到测试片的中央，轻轻覆盖上层膜，用压板平稳压下，使其均匀覆盖在测试片的圆形培养面积上，拿起压板，静置至少1 min,使培养基凝固。

　　将测试片的透明面朝上放置于培养箱内，堆叠不能超过20片，在25℃-28 ℃下培养3d-5d。

　　3.判读

　　培养3d后观察计数，如果5d后，测试片上的菌生长过快，出现边缘模糊的菌落，就用3d的计数结果作为估计菌落数。

　　在PYM测试片上，颜色均匀一致，灰白色到蓝绿色或粉红色，没有暗色中心，边界明显的小型隆起菌落计为酵母菌。颜色多样(棕色、米色、橙色、蓝绿色等)、中心颜色深暗的大型或小型扁平扩散菌落计为霉菌。

　　(四)结果计算

　　选取菌落数在15~150之间的测试片计数，平均菌落数乘以稀释倍数报告。

　　①如果所有稀释度的测试片上均无菌落生长，则以小于1乘以低稀释倍数报告。

　　②如果所有稀释度测试片上的菌落数都小于15,则计数稀释度低的测试片上的平均菌落数乘以稀释倍数报告。

　　③如果高稀释度的菌落数大于150,计数高稀释度的测试片上的平均菌落数乘以稀释倍数报告。计数菌落数大于150个的测试片时，可计数一个或两个具有代表性方格内的菌落数，换算成单个方格内(1cm2)的菌落数后乘以30即为测试片上估算的菌落数(圆形生长面积为30 cm)。

　　计数在测试片上出现堆积和彼此覆盖的霉菌菌落，可将测试片分成几个区域，计算每个明显暗色中心的菌落。大量的酵母菌可能会导致整个生长区域呈现蓝色，大量的霉菌也可导致整个生长区域呈现蓝、黑、黄等颜色，此时测试片中央可能没有可见菌落，但圆形培面积的边缘有许多小型菌落。当发生这种情况时，不要估算菌落数，其结果计为“多不可计“ (too numerous to count, TNTC)。

　　报告每克或每毫升样品中霉菌、酵母菌数，以“CFU/g或CFU/mL"表示。