1、细胞复苏
将冻存细胞从液氮中取出后，在37℃水浴锅内不断摇摆促进其融化。将融化的细胞移入离心管中，参加37℃预热的DMEM完全培育基中（其中胎牛血清约为10%），悄悄吹匀，离心，500g离心2min，弃上清液。
参加DMEM彻底培育基清洗，弃上清液。参加DMEM彻底培育基，悄悄吹打混匀，制成细胞悬液，接种于培育皿/瓶中，在含5% CO2的细胞培育箱中培育。
2、细胞传代
当细胞密度达到80%~90%（过早产值缺乏，过晚细胞状态欠安，1:2至1:10以上的比率传代培育，一般1:3至1:5细胞一代，即从细胞接种到别离再培育的一段时刻，非细胞有丝分裂次数）时，去掉彻底培育基，用1X PBS清洗2次。
参加胰蛋白酶（注意：消化液的量以盖住细胞很好，很好的消化温度是37℃。显微镜下调查细胞：倒置显微镜下调查消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此刻细胞消化适度）进行消化，放入细胞培育箱中约2-3min。
参加适量DMEM彻底培育基停止胰蛋白酶消化，转移至离心管后500g离心2min，弃上清液，再参加DMEM彻底培育基清洗，弃上清液。
参加DMEM彻底培育基，悄悄吹打混匀，吸取10微升进行计数，然后依照所需细胞量在含5% CO2的细胞培育箱持续培育。
3、细胞冻存
当细胞密度达到80%~90%时，去掉彻底培育基，用1X PBS清洗2次。参加胰蛋白酶进行消化，放入细胞培育箱中约2-3min。参加DMEM彻底培育基停止胰蛋白酶消化，转移至离心管后500g离心2min，弃上清液，再参加DMEM彻底培育基清洗，弃上清液。参加lml冻存液（90%胎牛血清，10%DMSO。 一般来讲血清含量能够在10%-90%之间调整，冻存液中参加血清一方面可认为细胞供给养分，另一方面能够在细胞冻存过程中供给非渗透性维护物质，如蔗糖，白蛋白等从而很好地维护细胞），放入冻存管内（管内有异丙醇，以确保温度下降的速度），当即放入4℃冰箱中冻存30min，然后放入-20℃冰箱中冻存30min，再置于-80℃冰箱内过夜。然后放入液氮中，能够保存至少两年，如不放人液氮，能够保存三个月。
细胞冻存和复苏的原则是：慢冻速融，这样也会有利于坚持细胞的生机。冻存细胞不加任何维护剂，会导致细胞内冰晶的产生，从而使细胞产生内源性的机械损伤，引起细胞内环境渗透压，PH，电解质等的改变，进而促使细胞逝世。
4、注意事项
（1）预热培育用液：把已经制造好的装有培育液、PBS和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热；
（2）用75%酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手；
（3）正确摆放运用的器械：确保足够的操作空间，不仅便于操作并且减少污染；
（4）点燃酒精灯：注意火焰不能太小；
（5）严厉的无菌操作；
（6）贴壁细胞消化适度：消化的时刻受消化液的品种、制造时刻、参加培育瓶中的量等诸多要素的影响，消化过程中应该注意培育细胞形状的变化，一旦胞质回缩，连接变松懈，或有成片浮起的痕迹就要当即停止消化；
（7）传代细胞一切的操作尽量靠近酒精灯火焰。每次还是要只进行一种细胞的操作，每种细胞运用一套器件。避免交叉感染；
（8）传代细胞瓶口每次翻开或许封闭都需要在酒精灯上消毒。
