由于遗传特性不同，适合各种微生物的保存方法也不同。一种良好有效的保存方法，首先要能长期保持原菌种的优异性质不变，同时还要考虑方法的通用性、操作的简单性和设备的普及性。以下是ATCC菌株的一些常用保存方法:

　　(一)斜面低温保存法

　　将菌种接种在合适的斜面培养基上，待菌种完全生长后，放入4℃左右的冰箱中保存，每隔一段时间(保存期)转移到新的斜面培养基上，生长后继续保存，如此持续。

　　这种方法广泛应用于大多数微生物菌种的短期保存，如细菌、放线菌、酵母菌和霉菌，不适合冷冻和干燥。放线菌、霉菌和有芽孢的细菌一般可以保存6个月左右，无芽孢的细菌可以保存1个月左右，酵母可以保存3个月左右。如果用橡皮塞代替棉塞，用石蜡密封，放在4℃的冰箱里保存，不仅可以防止水分挥发和隔氧，还可以防止棉塞受潮和污染。这种改进可以延长菌种的保质期。

　　由于该方法采用低温保存，微生物代谢繁殖速度大大降低，突变频率降低;同时也减少了培养基的水分蒸发，使其不会干裂。这种方法的优点是简单易行，易于推广，存活率高。因此，这种保存方法大多用于科学研究和生产中经常使用的菌种。它的缺点是菌株仍然具有一定程度的代谢活动能力，保存期短，传代次数多，菌株容易发生变异和污染。

　　(二)石蜡油密封法

　　这种方法是将灭菌、蒸发水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面(或半固体穿刺培养物)上，石蜡油层高于斜面顶部的lcm，使培养物与空气隔离，加入胶塞，用固体石蜡密封，然后垂直存放在室温或4℃的冰箱中。使用的液体石蜡需要优质、无毒、纯化学规格，灭菌条件如下:150～170℃烘箱内灭菌lh;或者121℃高压蒸汽灭菌60℃～80min，然后放在80℃的烤箱里烘干去除水分。

　　因为液体石蜡阻挡了空气，使细菌处于缺氧状态，防止水分挥发，使培养物不会开裂，因此可以使保质期达到1。～两年，或者更长。

　　这种方法操作简单，适用于保存霉菌、酵母、放线菌、好氧细菌等。它对保存霉菌和酵母有很好的效果，可以保存几年甚至10年。然而，它对许多厌氧细菌的保存效果很差，尤其是对一些能分解烃类的细菌。

　　根据实验，这种方法适合保存红曲霉，保存1～22年后的存活率为100%;还有报道显示，部分细菌丝采用石蜡油保存法，3～菌丝在6℃保存时容易死亡，而在室温下则比较理想，值得注意。

　　(三)砂土管保存法

　　这是一种常用的长期保存菌种的方法，适用于放线菌、霉菌和形成孢子的细菌，但不适用于奈氏球菌、弧菌、假单胞杆菌、酵母等一些对干燥敏感的细菌。

　　制作方法是先将砂和土分别清洗、干燥、过筛(一般砂采用60目筛，土采用120目筛)，按砂与土的比例(1。～2)：1混合均匀，分装在小试管中，砂土高度约1cm，蒸汽灭菌121℃。～1.5h，间歇杀菌3次。50℃干燥后，检查正确后备用。也有只用沙子或土壤作为载体保存的。需要保存的菌株先用斜面培养基充分培养，再用无菌水制成108～1010/ml菌悬液或孢子悬液滴入砂管中，放线菌和霉菌也可以直接刮下孢子与载体混合，然后放入干燥器中抽真空约2。～四小时内，用火焰熔封管口(或用石蜡封口)，放置在干燥器内，保存在室温或4℃的冰箱内，后者效果更好。

　　砂管法兼具低温、干燥、隔氧、无营养等条件，因此保质期长，效果好，微生物移接方便，经济简单。它的保质期比石蜡油密封法长，大约1。～十年。**科学院微生物研究所采用砂土管保存法保存放线菌。

　　(四)麸皮保存法

　　麸皮保存法又称曲法保存法。也就是说，它以麸皮为载体，吸附接入的孢子，然后在低温干燥条件下保存。制作方法是将麸皮和水按一定比例按照不同菌种对水的要求进行1。：(0.8～1.5)搅拌均匀，装量为试管体积的2/5。湿热灭菌后，冷却，接入新鲜培养的菌种，适温培养至孢子生长。将试管放入含有氯化钙等干燥剂的干燥器中，在室温下干燥几天，然后移至低温保存;干燥后，试管也可以用火焰熔封，然后保存，这样效果更好。

　　这种方法适用于孢子霉菌和一些放线菌的产生，保存期超过一年。由于操作简单，经济实惠，广泛应用于工厂。**科学院微生物研究所采用麸皮保存法保存曲霉，如米曲霉、黑曲霉、泡曲霉等。，其保存期可达数年至数十年。

　　(五)甘油悬液保存法

　　这种方法是将菌种悬浮在甘油蒸馏水中，低温保存。这种方法比较简单，但是需要配备低温冰箱。如果保存温度为-20℃，保存期约为0.5。～一年，而采用-70℃，保质期可达10年。

　　将拟保存菌种对数期的培养液直接与甘油混合，甘油经121℃蒸汽灭菌20分钟，甘油浓度为10%。～15%，再分装在小离心管里，放在低温冰箱里保存。这种方法经常用于基因工程细菌的保存。

　　(六)冷冻真空干燥保存法

　　冷冻真空干燥保存法，又称冷冻干燥保存法，简称冷冻干燥法。它通常用保护剂在安瓿管中制备细胞悬液或孢子悬液，然后在低温下快速冷冻含菌样品，减压抽真空，使水升华干燥样品脱水，形成完全干燥的固体菌块。并在真空条件下立即密封，导致无氧真空环境。*放在低温下，使微生物处于休眠状态，可长期保存。常用的保护剂包括脱脂牛奶、血清、淀粉、葡聚糖等高分子物质。

　　因为这种方法同时具有低温、干燥、缺氧的菌种保存条件，所以保存期长，一般达到5。～15年来，存活率高，变异率低，是目前广泛使用的理想保存方法。这种保存方法可用于大多数其他微生物，如病毒、细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌等。，除了不产生孢子的丝状真菌。但是这种方法操作繁琐，技术要求高，需要冻干机等设备。

　　当需要保存菌种时，可以在无菌环境下打开安瓿管，将无菌培养基注入安瓿管。固体菌块溶解后，摇匀复水，然后在适合菌种生长的斜面上接种，适当温度培养。

　　(七)液氮超低温保存法

　　液氮超低温保存法，简称液氮保存法或液氮保存法。它是以甘油、二甲基亚邈等为保护剂，在液氮超低温(-196℃)下保存的一种方法。其主要原理是菌种细胞从常温过渡到低温，使细胞内的自由水在降低到低温前通过细胞膜渗出，避免细胞因自由水凝结成冰晶而损伤膜内的细胞。当美国ATCC菌种保存中心采用这种方法时，通过控制菌悬液或带菌丝的琼脂块的冷却速度，每分钟降低1℃/分钟的速度从0℃降至-35℃，然后保存在-150℃。～-196℃液氮冷箱。如果冷却速度太快，冰晶会损伤细胞，因为细胞内的自由水没有时间渗出细胞。据研究，冷却速度控制在(1)～10)℃/min，细胞性死亡率低;死亡率随着速度的加快而相应增加。

　　低温保存液氮的保护剂一般选用甘油、二甲基亚邈、糊精、血清蛋白、聚乙烯氮戊环、吐温80等，但常用甘油(10%)～20%)。不同的微生物应该选择不同的保护剂，然后通过实验确定保护剂的浓度。原则上，保护剂的浓度应控制在不足以导致微生物死亡的浓度。

　　这种方法操作简单、高效、保存期一般可达15年以上，是目前公认的*有效菌种长期保存技术之一。该方法适用于保存各种微生物菌种，甚至藻类、原生动物、支原体等。用于有效保存。这种方法的另一个主要优点是可以用各种培养形式的微生物来保存，这种保存方法可以用于孢子或菌体、液体培养物或固体培养物。其缺点是需要购买超低温液氮设备，液氮消耗大，运行成本高。

　　使用菌种时，将安瓿瓶从液氮罐中取出，迅速放入35～在40℃的温水中，冷冻熔化，无菌操作打开安瓿瓶，移到保存前使用的同一培养基的斜面上进行培养。从液氮罐中取出安瓿瓶时，速度要快，一般不超过1分钟，防止其他安瓿瓶升温，影响保存质量。而且取样时一定要戴专用手套，防止意外爆炸和冻伤。

　　(八)宿主保存法

　　这种方法适用于专用活细胞寄生微生物(如病毒、立克次氏体等)。).它们只能寄生在活动植物或其他微生物体内，因此可以根据宿主细胞的特性进行保存。例如，植物病毒可以通过混合植物幼叶的汁液、冷冻或干燥来保存。噬菌体可以通过细菌培养扩大后直接与培养基混合保存。动物病毒可以直接用病毒感染合适的器官或体液，然后装入试管中密封，低温保存。

　　在上述菌种保存方法中，以斜面低温保存方法、石蜡油密封方法、宿主保存方法*为简单，其次是砂管保存方法、麸皮保存方法和甘油悬液保存方法;冷冻真空干燥保存方法和液氮超低温保存方法复杂，但保存效果好。应用时可根据实际需要选择。

　　“美国典型培养物收藏中心”(简称ATCC)是国际著名的“美国典型培养物收藏中心”，只采用两种有效的保存方法，即保存期一般达到5。～15年冷冻真空干燥保存法和液氮超低温保存法一般达到15年以上的保存期，以大限度地减少传代次数，避免菌种变异和衰退。中国的菌种保存多采用三种方法，即斜面低温保存法、液氮超低温保存法和冷冻真空干燥保存法。